El plan de Tuberculosis

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En nuestra quinta tira publicada en la revista Sem@foro de Diciembre 2020, Coco y Fran durante la pandemia humana también se dedicaron a mirar películas, la que más les gustó: el plan de tuberculosis.

GUI√ďN E ILUSTRACI√ďN: Alejandro Rodr√≠guez Juele y Nicol√°s Peruzzo.

MATERIAL CIENT√ćFICO/T√ČCNICO:  Andrea Villarino, Mariana Margenat, Vivian Irving, Tania Garc√≠a, Ana Mar√≠a Ferreira

ADAPTACI√ďN:  Daniela Arredondo, Valentina Carrasco, Mar√≠a Jos√© Gonz√°lez y Paola Scavone.

Proyecto FCE_2017_1_136458 financiado por ANII ( Agencia Nacional de Investigaci√≥n e innovaci√≥n): Avanzando en las v√≠as de se√Īalizaci√≥n eucariota moduladas por la fosfatasa PtpA


Leer m√°s sobre la Tuberculosis y las v√≠as de se√Īalizaci√≥n eucariota moduladas por la fosfatasa PtpA

Texto elaborado por: Andrea Villarino, Vivian Irving y Tania García

Resumen del proyecto Avanzando en las v√≠as de se√Īalizaci√≥n eucariota moduladas por la fosfatasa PtpA

Dentro de las bacterias patógenas existen algunas bacterias que logran entrar dentro de las células que infectan. Un ejemplo es Mycobacterium tuberculosis, bacteria responsable de la Tuberculosis en humanos.

Esta bacteria entra en las c√©lulas mediante un proceso llamado fagocitosis, llevado a cabo por c√©lulas del sistema inmunitario como los macr√≥fagos. El proceso de fagocitosis es parte de una ‚Äúlucha‚ÄĚ que se inicia entre la c√©lula animal y la bacteria.

La célula animal intentará destruir a la bacteria y si no lo logra buscará confinarla, controlando su multiplicación celular y diseminación hacia otros órganos. La bacteria en cambio intentará sobrevivir dentro de la célula del animal, usando los recursos energéticos de la célula para sobrevivir.

Es as√≠ que durante este proceso la bacteria inyecta varias prote√≠nas (factores de virulencia) dentro de la c√©lula animal. Estas prote√≠nas tratar√°n de alterar las funciones normales de la c√©lula infectada, con el objetivo de permitir que la bacteria persista dentro de las c√©lulas hasta encontrar el momento adecuado para multiplicarse a√ļn m√°s, momento en el cu√°l sale del macr√≥fago y se disemina hacia otros tejidos del animal.

Nuestro grupo trabaja estudiando una de las prote√≠nas que inyecta la bacteria una vez dentro de los macr√≥fagos. En especial tratamos de entender cu√°les son las funciones del macr√≥fago que esta prote√≠nas altera y que cambios causa en la c√©lula infectada que puedan ser ben√©ficos para la bacteria. La prote√≠na bacteriana en estudio se llama fosfatasa PtpA (PTP por la sigla en ingl√©s ‚Äúprotein tyrosine phosphatase‚ÄĚ) y se trata de una enzima hidrolasa responsable de eliminar grupos fosfatos de prote√≠nas situados en residuos de amino√°cido tirosina espec√≠ficos, proceso que se denomina desfosforilaci√≥n.

Las enzimas que eliminan y aquellas que agregan grupos fosfatos de prote√≠nas se denominan fosfatasas y quinasas, respectivamente. El agregado y remoci√≥n de grupos fosfato en diferentes prote√≠nas celulares permite encender y/o apagar r√°pidamente m√ļltiples funciones celulares, por lo cual se consideran enzimas claves en la adaptaci√≥n de las c√©lulas a diferentes situaciones, como puede ser la infecci√≥n.

Nuestra hip√≥tesis de trabajo se basa en demostrar que adem√°s de inhibir la respuesta inmune, PtpA tambi√©n participa re-direccionando el metabolismo del macr√≥fago. Esto permitir√≠a que recursos energ√©ticos de la c√©lula infectada est√©n disponibles para la bacteria, contribuyendo a la persistencia de la misma dentro de la c√©lula animal infectada. 

Proyecto FCE_2017_1_136458. Avanzando en las v√≠as de se√Īalizaci√≥n eucariota moduladas por la fosfatasa PtpA de Mycobacterium tuberculosis.

La tuberculosis (TB) es una enfermedad respiratoria causada por micobacterias del complejo TB. Dentro de este grupo se incluyen varias micobacterias que presentan similitud a nivel del ADN y ARN, aunque varían en el grado de patogenicidad, epidemiología y preferencia de huésped.

Son bacterias de crecimiento in vitro lento que presentan diferencias morfol√≥gicas y diferentes perfiles de resistencia y susceptibilidad a los antibi√≥ticos. La enfermedad causada por estas bacterias constituye un importante problema de salud p√ļblica ya que la transmisi√≥n es zoon√≥tica, es decir que se puede transmitir naturalmente de animales (usualmente vertebrados) a animales como el ser humano y viceversa.

La bacteria Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el agente etiológico de la TB humana, enfermedad respiratoria que constituye la décima causa de muerte en el mundo y la primera debida a enfermedades infecciosas (por encima del VIH/sida).

De acuerdo con datos de la OMS (Global Tuberculosis Report 2018) en 2017 unos 10 millones de personas enfermaron de TB y 1.6 millones murieron, entre ellos 230.000 ni√Īos. Un 90% de los infectados logra contener e incluso eliminar la infecci√≥n, estim√°ndose que 1/4 de la poblaci√≥n se encuentra infectada por la bacteria en estado latente.

Si bien a nivel mundial la incidencia de la TB est√° reduci√©ndose a un ritmo del 2% anual, en nuestro pa√≠s esto no sucede y se observa un aumento progresivo en los √ļltimos 10 a√Īos, superando los 26 casos cada 100.000 habitantes seg√ļn la Comisi√≥n Honoraria para la Lucha Antituberculosa y Enfermedades Prevalentes (chlaep). Esto se debe principalmente a la tardanza en el diagn√≥stico lo que causa que las medidas para evitar el contagio no se pongan en marcha a tiempo (OMS)

Mtb es una bacteria aeróbica descrita por primera vez en 1882 por el médico y microbiólogo alemán Robert Koch (Martínez et. al 1999).

Es un patógeno intracelular que se aloja principalmente en los pulmones (TB pulmonar), aunque es capaz de infectar otros órganos, siendo los más frecuentes la cavidad pleural, los ganglios linfáticos o áreas osteoarticulares (TB extrapulmonar) (Golden & Vikram 2005).

El ciclo de infecci√≥n de Mtb en humanos (Pai et. al 2016) comienza cuando Mtb ingresa por v√≠a a√©rea al ser aspirado, alcanza el espacio alveolar y se encuentra con una primera l√≠nea de defensa, los macr√≥fagos alveolares. Si los macr√≥fagos fallan en eliminar la bacteria, Mtb accede al tejido pulmonar intersticial y de esta forma activa c√©lulas dendr√≠ticas que transportan al pat√≥geno a trav√©s del par√©nquima pulmonar, lo que conduce al reclutamiento de un n√ļmero creciente de c√©lulas al sitio de infecci√≥n, generando una respuesta del hu√©sped multicelular llamada granuloma (Figura 1A). Esta estructura ordenada formada por c√©lulas de la inmunidad como macr√≥fagos, linfocitos B y T, busca contener el foco de infecci√≥n y favorecer la eliminaci√≥n del pat√≥geno, aunque desde la perspectiva del pat√≥geno es una creciente poblaci√≥n celular que sirve de nicho donde permanecer.

En el granuloma la bacteria puede persistir por largos per√≠odos (incluso a√Īos) y en algunos casos continuar su lenta replicaci√≥n. Cuando el sistema inmunitario de la persona se encuentra debilitado el granuloma falla en la contenci√≥n de la infecci√≥n, la carga bacteriana aumenta y el pat√≥geno mediante la circulaci√≥n sangu√≠nea alcanza otros √≥rganos e ingresa al tracto respiratorio para ser liberada al aire e infectar otra persona. En este punto de la infecci√≥n es que se habla de tuberculosis activa (Figura 1B).

Modificado de https://www.nature.com/articles/nrdp201676

Para prevenir la TB humana, en Uruguay y muchos otros pa√≠ses, se administra la vacuna intrad√©rmica Bacillus de Calmette y Gu√©rin (Mb BCG) a los reci√©n nacidos. La misma consiste en un extracto de bacterias vivas liofilizadas de Mb cepa BCG, de virulencia atenuada (Martin et. al 2018). Sin embargo la b√ļsqueda de nuevas vacunas contin√ļa, ya que la actual resulta efectiva en solo un 60-80 % de los ni√Īos y en los adultos el porcentaje de protecci√≥n es variable y mucho menor (Soysal et. al 2005). Hoy en d√≠a para prevenirla es fundamental asegurar un buen estado de salud de la poblaci√≥n y asegurando el diagn√≥stico precoz.


¬ŅC√≥mo prevenir la Tuberculosis?


Mediante un diagnóstico precoz, concurriendo a un servicio de salud para que te estudien, si toses y expectoras por más de dos semanas

Para el tratamiento de la TB humana existe una quimioterapia efectiva la cual utiliza 4 antibi√≥ticos de primer l√≠nea (rifampicina, isoniazida, etambutol, pirazinamida). Dicho tratamiento es muy largo, y las dificultades de implementaci√≥n, as√≠ como el abandono del mismo por los pacientes han favorecido la aparici√≥n de cepas resistentes a uno o m√°s de los antibi√≥ticos. Seg√ļn las estimaciones de las OMS en 2017 hubo 558.000 nuevos casos de resistencia a la rifampicina (antibi√≥tico de primera l√≠nea, m√°s eficaz) de los cuales el 82% padec√≠an TB resistente a m√°s de una droga (TB-MDR, OMS). Por lo cual, la b√ļsqueda de nuevos antibi√≥ticos contin√ļa y para ello es necesario conocer a√ļn m√°s sobre la interacci√≥n de la bacteria con las c√©lulas humanas.


¬ŅLa tuberculosis tiene cura?

Si, tiene

Para lograrla hay que detectarla a tiempo, hay que tomar los antibióticos que te indica el médico y es fundamental no abandonar el tratamiento.
Si no lo hacemos fomentamos el contagio y la aparición de bacterias que resisten a estos antibióticos.

Mtb es capaz de evadir la respuesta inmune del hospedero y sobrevivir dentro de los macrofagos (Nazarova & Russell 2017). Existen evidencias de que Mtb logra salir del fagosoma alcanzando el citosol de la célula infectada (Houben et. al., 2012), demostrándose una correlación entre la presencia de la bacteria en el citosol y el grado de patogenicidad.

Estas bacterias desde el citosol o desde el fagosoma son capaces de introducir en la c√©lula infectada diferentes factores de virulencia, por ejemplo enzimas como quinasas y fosfatasas, capaces de modular importantes v√≠as de se√Īalizaci√≥n celular eucariota (Wong et. al 2011; Brosch et. al 1998; Wang et. al 2017). Un ejemplo es la fosfatasa de tirosina PtpA, para la cual existen evidencias que indican es introducida dentro del citosol del macr√≥fago durante la infecci√≥n tanto por Mtb como por la cepa vacunal Mb BCG (Brosch et. al 1998; Wang et. al 2017). Por el contrario, M. smegmatis, micobacteria que no pertenece al complejo TB como Mtb y Mb, no alcanza el citosol durante la infecci√≥n y si bien cuenta con el gen de PtpA, el producto del mismo da lugar a una fosfatasa menos activa in vitro que la generada por Mtb (Chatterjee et. al 2015). 

Por otro lado, estudios con cepas de Mtb dónde se eliminó el gen de PtpA demuestran que esta fosfatasa es un factor de virulencia, ya que estas cepas son menos exitosas en la infección tanto de macrófagos como en modelos animales (ratones SPF C57BL/6) (Bach et. al 2008; Wang et. al 2015), en comparación con la cepa salvaje de Mtb.

Existen evidencias que demuestran que PtpA, junto a otros factores de virulencia bacterianos participa, en bloquear la acidificación del fagolisosoma del macrófago deteniendo su maduración (desfosforilando Vacuolar Protein sorting 33B, VPS33B) (Bach et. al 2008) y evitando así la destrucción de la bacteria.

Adem√°s PtpA tiene un rol importante en la modulaci√≥n de la inmunidad innata, ya que su actividad correlaciona con la disminuci√≥n de citoquinas pro-inflamatorias como TNF…Ď e IL-1ő≤ e IL-12 (Wang et. al 2015). PtpA participa tambi√©n en inhibir la apoptosis actuando sobre la glic√≥geno sintasa quinasa (GSK3őĪ), enzima implicada en la activaci√≥n de la v√≠a apopt√≥tica celular (Poirier et. al 2014).

Por otro lado, nuestro grupo report√≥ un potencial rol de PtpA en la modulaci√≥n del metabolismo energ√©tico (Margenat et. al 2015). En dicho trabajo se reportaron cuatro potenciales sustratos eucariotas de PtpA, todos ellos relacionados directa o indirectamente con el metabolismo energ√©tico del macr√≥fago. Tres de ellos son prote√≠nas sintetizadas en el citosol pero que act√ļan en la mitocondria:

  • la subunidad alfa de la prote√≠na trifuncional (TFP-ECHA),
  • la subunidad alfa de la ATP sintasa (ATPA), y
  • la sulfuro quinona oxidorreductasa (SQRD).

El cuarto candidato, es una enzima citosólica clave de la regulación de la glucólisis, la 6-fosfofructo quinasa (K6PP). Sumado a esto, estudios realizados con macrófagos infectados con la cepa virulenta Mtb H37Rv y no-virulenta Mtb H37Ra (Jamwal et. al 2013) muestran alteraciones en el proteoma mitocondrial del macrófago durante la infección.

Los autores observan que seis proteínas dejan de ser detectadas en la mitocondria durante la infección de los macrófagos con la cepa virulenta, y no en la infección con la cepa no-virulenta. Lo interesante es que tres de ellas son las proteínas mitocondriales descritas por nuestro grupo como potenciales sustratos de PtpA, la SQRD, ATPA y ECHA (Margenat et. al 2015).

El o los factores de virulencia responsables de estos cambios en el macr√≥fago a√ļn no se conocen, lo que motiva que nuestro grupo est√© profundizando en entender como PtpA act√ļa sobre estos nuevos candidatos a sustrato.

En la literatura también se encuentran estudios recientes que demuestran que durante la infección con Mtb el metabolismo de la célula hospedera es modulado (Cumming et. al 2018; Gleeson et. al 2016).

En este contexto, uno de los objetivos centrales de nuestro grupo es evaluar la hip√≥tesis de que PtpA, actuando sobre uno o m√°s de los candidatos identificados como potenciales sustratos, sea capaz de modular el metabolismo del macr√≥fago durante la infecci√≥n, actividades que se est√°n desarrollando en el marco del proyecto Fondo Clemente Estable en curso. 

En estos dos a√Īos de proyecto el grupo ha avanzado en obtener diferentes tipos de modelos de estudio para abordar dicha hip√≥tesis.

Uno de ellos consiste en cultivos de macrófagos humanos en los cuales se introdujo mediante técnicas moleculares (transfección y transducción y pinocitosis) la fosfatasa PtpA activa (capaz de desfosforilar una P-Y), y una versión mutada de PtpA inactiva (incapaz de desfosforilar una P-Y). Además se obtuvo la cepa de M.tuberculosis carente del gen de PtpA.

En el tercer a√Īo comenzamos a evaluar, en las prote√≠nas de macr√≥fago identificadas por nuestro grupo como candidatas a sustrato de PtpA, si existen cambios en la fosforilaci√≥n en tirosina y localizaci√≥n sub-celular asociados a la actividad de PtpA. A su vez en dichos modelos comenzamos la evaluaci√≥n de potenciales cambios en el perfil metab√≥lico del macr√≥fago que puedan correlacionar con la actividad de la fosfatasa bacteriana PtpA.

Por más información sobre esta investigación comunicarse con Andrea Villarino