El plan de Tuberculosis

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En nuestra quinta tira publicada en la revista Sem@foro de Diciembre 2020, Coco y Fran durante la pandemia humana también se dedicaron a mirar películas, la que más les gustó: el plan de tuberculosis.

GUIÓN E ILUSTRACIÓN: Alejandro Rodríguez Juele y Nicolás Peruzzo.

MATERIAL CIENTÍFICO/TÉCNICO:  Andrea Villarino, Mariana Margenat, Vivian Irving, Tania García, Ana María Ferreira

ADAPTACIÓN:  Daniela Arredondo, Valentina Carrasco, María José González y Paola Scavone.

Proyecto FCE_2017_1_136458 financiado por ANII ( Agencia Nacional de Investigación e innovación): Avanzando en las vías de señalización eucariota moduladas por la fosfatasa PtpA


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Texto elaborado por: Andrea Villarino, Vivian Irving y Tania García

Resumen del proyecto Avanzando en las vías de señalización eucariota moduladas por la fosfatasa PtpA

Dentro de las bacterias patógenas existen algunas bacterias que logran entrar dentro de las células que infectan. Un ejemplo es Mycobacterium tuberculosis, bacteria responsable de la Tuberculosis en humanos.

Esta bacteria entra en las células mediante un proceso llamado fagocitosis, llevado a cabo por células del sistema inmunitario como los macrófagos. El proceso de fagocitosis es parte de una “lucha” que se inicia entre la célula animal y la bacteria.

La célula animal intentará destruir a la bacteria y si no lo logra buscará confinarla, controlando su multiplicación celular y diseminación hacia otros órganos. La bacteria en cambio intentará sobrevivir dentro de la célula del animal, usando los recursos energéticos de la célula para sobrevivir.

Es así que durante este proceso la bacteria inyecta varias proteínas (factores de virulencia) dentro de la célula animal. Estas proteínas tratarán de alterar las funciones normales de la célula infectada, con el objetivo de permitir que la bacteria persista dentro de las células hasta encontrar el momento adecuado para multiplicarse aún más, momento en el cuál sale del macrófago y se disemina hacia otros tejidos del animal.

Nuestro grupo trabaja estudiando una de las proteínas que inyecta la bacteria una vez dentro de los macrófagos. En especial tratamos de entender cuáles son las funciones del macrófago que esta proteínas altera y que cambios causa en la célula infectada que puedan ser benéficos para la bacteria. La proteína bacteriana en estudio se llama fosfatasa PtpA (PTP por la sigla en inglés “protein tyrosine phosphatase”) y se trata de una enzima hidrolasa responsable de eliminar grupos fosfatos de proteínas situados en residuos de aminoácido tirosina específicos, proceso que se denomina desfosforilación.

Las enzimas que eliminan y aquellas que agregan grupos fosfatos de proteínas se denominan fosfatasas y quinasas, respectivamente. El agregado y remoción de grupos fosfato en diferentes proteínas celulares permite encender y/o apagar rápidamente múltiples funciones celulares, por lo cual se consideran enzimas claves en la adaptación de las células a diferentes situaciones, como puede ser la infección.

Nuestra hipótesis de trabajo se basa en demostrar que además de inhibir la respuesta inmune, PtpA también participa re-direccionando el metabolismo del macrófago. Esto permitiría que recursos energéticos de la célula infectada estén disponibles para la bacteria, contribuyendo a la persistencia de la misma dentro de la célula animal infectada. 

Proyecto FCE_2017_1_136458. Avanzando en las vías de señalización eucariota moduladas por la fosfatasa PtpA de Mycobacterium tuberculosis.

La tuberculosis (TB) es una enfermedad respiratoria causada por micobacterias del complejo TB. Dentro de este grupo se incluyen varias micobacterias que presentan similitud a nivel del ADN y ARN, aunque varían en el grado de patogenicidad, epidemiología y preferencia de huésped.

Son bacterias de crecimiento in vitro lento que presentan diferencias morfológicas y diferentes perfiles de resistencia y susceptibilidad a los antibióticos. La enfermedad causada por estas bacterias constituye un importante problema de salud pública ya que la transmisión es zoonótica, es decir que se puede transmitir naturalmente de animales (usualmente vertebrados) a animales como el ser humano y viceversa.

La bacteria Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el agente etiológico de la TB humana, enfermedad respiratoria que constituye la décima causa de muerte en el mundo y la primera debida a enfermedades infecciosas (por encima del VIH/sida).

De acuerdo con datos de la OMS (Global Tuberculosis Report 2018) en 2017 unos 10 millones de personas enfermaron de TB y 1.6 millones murieron, entre ellos 230.000 niños. Un 90% de los infectados logra contener e incluso eliminar la infección, estimándose que 1/4 de la población se encuentra infectada por la bacteria en estado latente.

Si bien a nivel mundial la incidencia de la TB está reduciéndose a un ritmo del 2% anual, en nuestro país esto no sucede y se observa un aumento progresivo en los últimos 10 años, superando los 30 casos cada 100.000 habitantes según la Comisión Honoraria para la Lucha Antituberculosa y Enfermedades Prevalentes (chlaep). Esto se debe principalmente a la tardanza en el diagnóstico lo que causa que las medidas para evitar el contagio no se pongan en marcha a tiempo (OMS)

Mtb es una bacteria aeróbica descrita por primera vez en 1882 por el médico y microbiólogo alemán Robert Koch (Martínez et. al 1999).

Es un patógeno intracelular que se aloja principalmente en los pulmones (TB pulmonar), aunque es capaz de infectar otros órganos, siendo los más frecuentes la cavidad pleural, los ganglios linfáticos o áreas osteoarticulares (TB extrapulmonar) (Golden & Vikram 2005).

El ciclo de infección de Mtb en humanos (Pai et. al 2016) comienza cuando Mtb ingresa por vía aérea al ser aspirado, alcanza el espacio alveolar y se encuentra con una primera línea de defensa, los macrófagos alveolares. Si los macrófagos fallan en eliminar la bacteria, Mtb accede al tejido pulmonar intersticial y de esta forma activa células dendríticas que transportan al patógeno a través del parénquima pulmonar, lo que conduce al reclutamiento de un número creciente de células al sitio de infección, generando una respuesta del huésped multicelular llamada granuloma (Figura 1A). Esta estructura ordenada formada por células de la inmunidad como macrófagos, linfocitos B y T, busca contener el foco de infección y favorecer la eliminación del patógeno, aunque desde la perspectiva del patógeno es una creciente población celular que sirve de nicho donde permanecer.

En el granuloma la bacteria puede persistir por largos períodos (incluso años) y en algunos casos continuar su lenta replicación. Cuando el sistema inmunitario de la persona se encuentra debilitado el granuloma falla en la contención de la infección, la carga bacteriana aumenta y el patógeno mediante la circulación sanguínea alcanza otros órganos e ingresa al tracto respiratorio para ser liberada al aire e infectar otra persona. En este punto de la infección es que se habla de tuberculosis activa (Figura 1B).

Modificado de https://www.nature.com/articles/nrdp201676

Para prevenir la TB humana, en Uruguay y muchos otros países, se administra la vacuna intradérmica Bacillus de Calmette y Guérin (Mb BCG) a los recién nacidos. La misma consiste en un extracto de bacterias vivas liofilizadas de Mb cepa BCG, de virulencia atenuada (Martin et. al 2018). Sin embargo la búsqueda de nuevas vacunas continúa, ya que la actual resulta efectiva en solo un 60-80 % de los niños y en los adultos el porcentaje de protección es variable y mucho menor (Soysal et. al 2005). Hoy en día para prevenirla es fundamental asegurar un buen estado de salud de la población y asegurando el diagnóstico precoz.


¿Cómo prevenir la Tuberculosis?


Mediante un diagnóstico precoz, concurriendo a un servicio de salud para que te estudien, si toses y expectoras por más de dos semanas

Para el tratamiento de la TB humana existe una quimioterapia efectiva la cual utiliza 4 antibióticos de primer línea (rifampicina, isoniazida, etambutol, pirazinamida). Dicho tratamiento es muy largo, y las dificultades de implementación, así como el abandono del mismo por los pacientes han favorecido la aparición de cepas resistentes a uno o más de los antibióticos. Según las estimaciones de las OMS en 2017 hubo 558.000 nuevos casos de resistencia a la rifampicina (antibiótico de primera línea, más eficaz) de los cuales el 82% padecían TB resistente a más de una droga (TB-MDR, OMS). Por lo cual, la búsqueda de nuevos antibióticos continúa y para ello es necesario conocer aún más sobre la interacción de la bacteria con las células humanas.


¿La tuberculosis tiene cura?

Si, tiene

Para lograrla hay que detectarla a tiempo, hay que tomar los antibióticos que te indica el médico y es fundamental no abandonar el tratamiento.
Si no lo hacemos fomentamos el contagio y la aparición de bacterias que resisten a estos antibióticos.

Mtb es capaz de evadir la respuesta inmune del hospedero y sobrevivir dentro de los macrofagos (Nazarova & Russell 2017). Existen evidencias de que Mtb logra salir del fagosoma alcanzando el citosol de la célula infectada (Houben et. al., 2012), demostrándose una correlación entre la presencia de la bacteria en el citosol y el grado de patogenicidad.

Estas bacterias desde el citosol o desde el fagosoma son capaces de introducir en la célula infectada diferentes factores de virulencia, por ejemplo enzimas como quinasas y fosfatasas, capaces de modular importantes vías de señalización celular eucariota (Wong et. al 2011; Brosch et. al 1998; Wang et. al 2017). Un ejemplo es la fosfatasa de tirosina PtpA, para la cual existen evidencias que indican es introducida dentro del citosol del macrófago durante la infección tanto por Mtb como por la cepa vacunal Mb BCG (Brosch et. al 1998; Wang et. al 2017). Por el contrario, M. smegmatis, micobacteria que no pertenece al complejo TB como Mtb y Mb, no alcanza el citosol durante la infección y si bien cuenta con el gen de PtpA, el producto del mismo da lugar a una fosfatasa menos activa in vitro que la generada por Mtb (Chatterjee et. al 2015). 

Por otro lado, estudios con cepas de Mtb dónde se eliminó el gen de PtpA demuestran que esta fosfatasa es un factor de virulencia, ya que estas cepas son menos exitosas en la infección tanto de macrófagos como en modelos animales (ratones SPF C57BL/6) (Bach et. al 2008; Wang et. al 2015), en comparación con la cepa salvaje de Mtb.

Existen evidencias que demuestran que PtpA, junto a otros factores de virulencia bacterianos participa, en bloquear la acidificación del fagolisosoma del macrófago deteniendo su maduración (desfosforilando Vacuolar Protein sorting 33B, VPS33B) (Bach et. al 2008) y evitando así la destrucción de la bacteria.

Además PtpA tiene un rol importante en la modulación de la inmunidad innata, ya que su actividad correlaciona con la disminución de citoquinas pro-inflamatorias como TNFɑ e IL-1β e IL-12 (Wang et. al 2015). PtpA participa también en inhibir la apoptosis actuando sobre la glicógeno sintasa quinasa (GSK3α), enzima implicada en la activación de la vía apoptótica celular (Poirier et. al 2014).

Por otro lado, nuestro grupo reportó un potencial rol de PtpA en la modulación del metabolismo energético (Margenat et. al 2015). En dicho trabajo se reportaron cuatro potenciales sustratos eucariotas de PtpA, todos ellos relacionados directa o indirectamente con el metabolismo energético del macrófago. Tres de ellos son proteínas sintetizadas en el citosol pero que actúan en la mitocondria:

  • la subunidad alfa de la proteína trifuncional (TFP-ECHA),
  • la subunidad alfa de la ATP sintasa (ATPA), y
  • la sulfuro quinona oxidorreductasa (SQRD).

El cuarto candidato, es una enzima citosólica clave de la regulación de la glucólisis, la 6-fosfofructo quinasa (K6PP). Sumado a esto, estudios realizados con macrófagos infectados con la cepa virulenta Mtb H37Rv y no-virulenta Mtb H37Ra (Jamwal et. al 2013) muestran alteraciones en el proteoma mitocondrial del macrófago durante la infección.

Los autores observan que seis proteínas dejan de ser detectadas en la mitocondria durante la infección de los macrófagos con la cepa virulenta, y no en la infección con la cepa no-virulenta. Lo interesante es que tres de ellas son las proteínas mitocondriales descritas por nuestro grupo como potenciales sustratos de PtpA, la SQRD, ATPA y ECHA (Margenat et. al 2015).

El o los factores de virulencia responsables de estos cambios en el macrófago aún no se conocen, lo que motiva que nuestro grupo esté profundizando en entender como PtpA actúa sobre estos nuevos candidatos a sustrato.

En la literatura también se encuentran estudios recientes que demuestran que durante la infección con Mtb el metabolismo de la célula hospedera es modulado (Cumming et. al 2018; Gleeson et. al 2016).

En este contexto, uno de los objetivos centrales de nuestro grupo es evaluar la hipótesis de que PtpA, actuando sobre uno o más de los candidatos identificados como potenciales sustratos, sea capaz de modular el metabolismo del macrófago durante la infección, actividades que se están desarrollando en el marco del proyecto Fondo Clemente Estable en curso. 

En estos dos años de proyecto el grupo ha avanzado en obtener diferentes tipos de modelos de estudio para abordar dicha hipótesis.

Uno de ellos consiste en cultivos de macrófagos humanos en los cuales se introdujo mediante técnicas moleculares (transfección y transducción y pinocitosis) la fosfatasa PtpA activa (capaz de desfosforilar una P-Y), y una versión mutada de PtpA inactiva (incapaz de desfosforilar una P-Y). Además se obtuvo la cepa de M.tuberculosis carente del gen de PtpA.

En el tercer año comenzamos a evaluar, en las proteínas de macrófago identificadas por nuestro grupo como candidatas a sustrato de PtpA, si existen cambios en la fosforilación en tirosina y localización sub-celular asociados a la actividad de PtpA. A su vez en dichos modelos comenzamos la evaluación de potenciales cambios en el perfil metabólico del macrófago que puedan correlacionar con la actividad de la fosfatasa bacteriana PtpA.

Por más información sobre esta investigación comunicarse con Andrea Villarino